分子生物學(xué)標(biāo)記物有何進(jìn)展

　　卵母細(xì)胞質(zhì)量是影響輔助生殖(assistedreproductivetechniques，ART)治療結(jié)局的關(guān)鍵因素之一，因此，正確評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量的意義尤為重大。目前卵母細(xì)胞質(zhì)量的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)尚無定論，形態(tài)學(xué)評(píng)估雖因其直觀易于操作而廣泛應(yīng)用于臨床，但該方法存在的較強(qiáng)主觀性造成了其在臨床應(yīng)用中的局限性，而直接對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)層面的質(zhì)量檢測(cè)又常常損傷其活力，缺乏實(shí)用性，因此，尋找一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確而無創(chuàng)的卵母細(xì)胞質(zhì)量評(píng)估方法顯得尤為重要。

　　卵泡由卵母細(xì)胞及其周圍的體細(xì)胞構(gòu)成，卵泡的發(fā)育從始基卵泡開始，經(jīng)歷了初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡階段成為成熟卵泡，卵泡液由卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞分泌，含有多種物質(zhì)，如各種甾體激素、細(xì)胞因子、代謝物質(zhì)等，對(duì)卵泡的整個(gè)生命周期起著重要作用。

　　1甾體激素

　　1.1雌激素(E2)

　　E2可與顆粒細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞上的促性腺激素受體和甾體激素受體的表達(dá)，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)閉鎖卵泡的卵泡液中E2水平低，同時(shí)臨床中也發(fā)現(xiàn)E2合成障礙患者常發(fā)生卵泡閉鎖和多囊卵巢綜合征，且對(duì)促性腺激素反應(yīng)性低[1]，說明卵泡液E2水平可直接影響卵子質(zhì)量，進(jìn)而影響受精卵的卵裂和胚胎的質(zhì)量。

　　1.2孕激素(P)

　　隨著卵泡逐漸發(fā)育成熟，優(yōu)勢(shì)卵泡液中的P濃度逐漸增加，可抑制顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其黃素化[2]，并同時(shí)卵泡液中高濃度的E2一起直接調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞功能，促進(jìn)有受精能力的卵母細(xì)胞形成，提示卵泡液中適量的E2和P可促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，P/E2的值可能反映了卵母細(xì)胞的成熟程度。

　　1.3雄激素(T)高水平

　　T易使卵泡發(fā)生閉鎖，T和E2比值高低也可反映卵母細(xì)胞質(zhì)量[3]，比值低時(shí)卵泡發(fā)育好，比值中等時(shí)卵泡部分發(fā)生退變，比值高時(shí)卵泡迅速退變閉鎖。有實(shí)驗(yàn)表明血清T濃度與卵泡液T濃度無相關(guān)，因此高血清T濃度并不一定預(yù)示著高卵泡液T濃度[4]。

　　2促性腺激素

　　2.1卵泡刺激素(FSH)

　　正常卵泡發(fā)育過程中有起始募集和周期募集兩個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)，起始募集不依賴FSH的刺激，而周期募集依賴于FSH，只有對(duì)FSH敏感的卵泡才能發(fā)育成為優(yōu)勢(shì)卵泡，因此FSH是早期竇卵泡存活的重要因素，它能抑制無血清培養(yǎng)液中的竇前及竇卵泡的凋亡，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖與P的分泌，逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的抑制作用[5]。

　　2.2黃體生成素(LH)高水平

　　FSH和LH在卵泡發(fā)育初期有利于顆粒細(xì)胞增殖、竇腔形成，但若延長(zhǎng)顆粒細(xì)胞在含高濃度FSH和LH培養(yǎng)液的時(shí)間可致其早期分化和黃素化，導(dǎo)致MII卵母細(xì)胞和囊胚形成較少[6]。此外，高水平LH會(huì)刺激膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素，可能導(dǎo)致顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的死亡。因此適當(dāng)濃度的FSH和LH是保證卵母細(xì)胞胞漿及核同步成熟的基礎(chǔ)，但具體濃度還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

　　3細(xì)胞因子

　　3.1抗苗勒管激素(anti-Müllerianhormone，AMH)

　　AMH隸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子â(TGF-â)超家族，由卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，可通過抑制卵泡的募集和降低卵泡對(duì)FSH的敏感性來抑制優(yōu)勢(shì)卵泡形成，防止卵泡池過快消耗。血清和卵泡液AMH的水平均可預(yù)測(cè)卵巢的反應(yīng)性，但血清AMH不能預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局[7]，卵泡液中AMH可促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育，提高受精卵發(fā)育潛能，提示卵泡液AMH水平可能與卵母細(xì)胞質(zhì)量正相關(guān)。

　　3.2生長(zhǎng)分化因子-9(growthdifferentiationfactor-9，GDF-9)

　　和骨形成蛋白-15(bonemorphogeneticprotein-15，BMP-15)GDF-9和與其高度同源的BMP-15(又名GDF-9B)均隸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-â(TGF-â)超家族，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，GDF-9或BMP-15基因缺陷的小鼠均表現(xiàn)為不孕。多項(xiàng)研究表明人卵泡液中GDF-9、BMP-15水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量正相關(guān)[8]，可作為評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量、預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的客觀指標(biāo)。3.3抑制素(Inhibin，INH)INH可直接反映顆粒細(xì)胞的功能并且參與調(diào)節(jié)FSH的合成與分泌。抑制素B(inhibinB，INHB)隸屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-13(TGF-13)超家族，由顆粒細(xì)胞分泌，可反饋性抑制FSH的分泌，且INHB與獲卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)呈顯著正相關(guān)，提示INHB與卵泡的發(fā)育和繼續(xù)成熟密切相關(guān)[9]，因此認(rèn)為INHB水平可作為預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備力及卵母細(xì)胞質(zhì)量的卵泡液標(biāo)記物。3.4白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)LIF隸屬于白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)家族，在人類卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、胚胎的發(fā)育與著床等方面起著重要作用。卵泡液中LIF濃度在排卵時(shí)顯著升高且高于外周血濃度，成熟卵的卵泡液中LIF水平也顯著高于成熟前水平，若LIF表達(dá)減弱或缺失可致不孕。研究證明卵泡液中LIF可提高正常受精數(shù)及可移植胚胎數(shù)，能調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育[10]，可以作為預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的依據(jù)，但胚胎培養(yǎng)液中的LIF適宜濃度仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

　　3.5腫瘤壞死因子-á(tumornecrosisfactor，TNF-á)

　　TNF-á屬于Thl型細(xì)胞因子，TNF-á可通過與顆粒細(xì)胞上的TNF-á受體結(jié)合調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的凋亡。IL-6屬于Th2型細(xì)胞因子，這兩種類型免疫細(xì)胞間的平衡對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)意義重大[11]。TNF-á與IL-6可分別近似代表Th1型與Th2型免疫細(xì)胞的免疫活性，卵泡液中IL-6/TNF-á比值可能與不同妊娠結(jié)局相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[12]，卵泡液IL-6/TNF-á比值隨著獲卵數(shù)的增加逐漸上升，且該值與胚胎質(zhì)量和妊娠關(guān)系密切，比值越高胚胎質(zhì)量越好，容易妊娠，反之則胚胎質(zhì)量越差，不易妊娠。而卵泡液中IL-6/TNF-á比值是否存在最高閾值則有待進(jìn)一步研究以明確。3.6血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)VEGF存在于人卵泡液中，可誘導(dǎo)卵泡周圍微毛細(xì)血管形成，有利于卵泡從血液中吸收必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供自身生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)也有利于其接受血液循環(huán)來源的FSH和LH的刺激進(jìn)一步發(fā)育成熟，并使卵巢內(nèi)部產(chǎn)生VEGF。有研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中低VEGF水平的優(yōu)質(zhì)胚胎具有高種植能力，而卵泡液中高VEGF含量則預(yù)示著為胚胎發(fā)育不良，提示卵泡液中VEGF可能可以作為預(yù)測(cè)胚胎移植后結(jié)局的參考指標(biāo)[13]。

　　3.7胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulinlikegrowthfactor，IGF)IGF可分為IGF-I和IGF-II。IGF-I局限表達(dá)于正常有腔卵泡的顆粒細(xì)胞，具有較強(qiáng)促細(xì)胞分裂作用，較弱胰島素樣作用;IGF-II亦主要由顆粒細(xì)胞合成，但與IGF-I相反，具有較強(qiáng)胰島素樣作用，較弱促細(xì)胞分裂作用。IGF-I又名生長(zhǎng)介素，其濃度由生長(zhǎng)激素(growthhormone，GH)調(diào)節(jié)，臨床中發(fā)現(xiàn)卵巢低反應(yīng)的患者加用GH可以增強(qiáng)卵巢對(duì)外源性Gn的反應(yīng)性[14]，因此Gn和IGF-I在卵泡發(fā)育和成熟過程中起著協(xié)同作用。還有研究表明IGF-I與FSH可通過相互促進(jìn)對(duì)方受體的表達(dá)來增強(qiáng)相互之間的生物效應(yīng)。此外，IGF還能促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌VEGF誘導(dǎo)卵泡發(fā)育成熟，因此，卵泡液中IGF水平可作為預(yù)測(cè)卵泡及胚胎發(fā)育以及妊娠結(jié)局的參考指標(biāo)之一。

　　4小分子RNA(micro-RNA，miRNA)

　　miRNA是一類內(nèi)源性單鏈非編碼的小分子RNA，可介導(dǎo)卵母細(xì)胞DNA甲基化與顆粒細(xì)胞凋亡，并間接影響類固醇激素的合成與分泌。DaSilveira等[15]通過檢測(cè)女性卵泡液中顆粒細(xì)胞中miRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其存在年齡段差異，部分為年輕組特有，部分只存在于老年組;而共有的miRNA中多數(shù)在老年組的表達(dá)明顯高于年輕組，這種表達(dá)差異可能提示卵泡液中miRNA水平或可作為預(yù)測(cè)年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞質(zhì)量的參考指標(biāo)。

　　5基因

　　卵丘細(xì)胞中與氧化應(yīng)激相關(guān)的iNOS基因、HO-1基因與卵泡內(nèi)單精子注射受精成功率降低有關(guān)，卵丘細(xì)胞基因中COX2，GREM1，HAS2基因的高轉(zhuǎn)錄水平與高質(zhì)量胚胎正相關(guān)[16]，或可作為卵母細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)記物。顆粒細(xì)胞卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因PTX3也與胚胎質(zhì)量相關(guān)[17]，但目前其基因表達(dá)與卵母細(xì)胞質(zhì)量之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。6ROS(活性氧簇)ROS可分為3種類型：超氧自由基(O：-)、羥基(OH-)和過氧化氫(H：O：)，過量ROS是造成DNA損傷的主要原因，正常生理?xiàng)l件下，ROS在體內(nèi)不斷產(chǎn)生和被清除，使其濃度維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，但體外發(fā)育的胚胎周圍環(huán)境中氧氣濃度與體內(nèi)發(fā)育有很大差異，導(dǎo)致細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)生的ROS不能及時(shí)清除，而體外環(huán)境進(jìn)一步誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS蓄積，對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的產(chǎn)生毒性作用，最終誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及減數(shù)分裂中非整倍體的產(chǎn)生[18]，但ROS需具體維持在何種水平目前尚無定論。

　　7端粒酶

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)顆粒細(xì)胞端粒酶活性可通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞來調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的活化或退化。正常婦女卵巢中端粒酶活性隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降，排卵功能失調(diào)患者端粒酶活性水平通常較高，而卵泡衰竭患者端粒酶活性水平則通常較低，有學(xué)者認(rèn)為顆粒細(xì)胞端粒長(zhǎng)度縮短可能是造成卵巢功能降低的原因之一，推測(cè)顆粒細(xì)胞端粒酶活性及其端粒長(zhǎng)度可能是預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能的敏感指標(biāo)[19]，也可間接反映卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量并預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局。

　　8小結(jié)

　　卵泡液因其取材方便、含有眾多卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的因子而備受關(guān)注，然而要從中篩選出靈敏度高、特異性好的卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的標(biāo)記物還需更深入的研究。目前越來越多的與卵母細(xì)胞質(zhì)量正相關(guān)的卵泡液標(biāo)記物已被發(fā)現(xiàn)，未來可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探索這些因子在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程中的最適濃度，甚至可以同時(shí)研究幾個(gè)關(guān)系密切的細(xì)胞因子，探索其相互作用的機(jī)理，為今后更好地預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高臨床妊娠率，優(yōu)化胚胎培養(yǎng)液的成分，獲得更高質(zhì)量胚胎，改善ART結(jié)局提供有力的證據(jù)支持。

　　閱讀期刊：生物進(jìn)化

　　《生物進(jìn)化》該刊物的宗旨關(guān)注三十八億年以來的生命歷史和生物進(jìn)化這一人類關(guān)心的永恒主題。我們有責(zé)任、有義務(wù)讓公眾科學(xué)地認(rèn)識(shí)和了解地球生命漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程。加強(qiáng)人們對(duì)地球和生物進(jìn)化中發(fā)生事件的危機(jī)感和應(yīng)對(duì)能力，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)人類和諧、長(zhǎng)久、健康地發(fā)展。