甜瓜種質(zhì)資源多樣性如何分析

　　采用EST-SSR標(biāo)記對59份甜瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行研究。結(jié)果表明，46對EST-SSR標(biāo)記中有23對擴增出多態(tài)性，EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息含量值的分布范圍為0.239～0.588，平均值為0.386;46個標(biāo)記共檢測到54個多態(tài)性位點，種質(zhì)兩兩之間的簡單匹配系數(shù)范圍為0～0.981;聚類結(jié)果表明，在相似系數(shù)為0.19處，59份甜瓜種質(zhì)可以分為2類，接下來小編簡單介紹一篇優(yōu)秀農(nóng)業(yè)論文。

　　甜瓜是重要的經(jīng)濟作物之一，在國內(nèi)外廣泛栽培。我國是甜瓜生產(chǎn)大國，甜瓜收獲面積和產(chǎn)量分別占全球總面積的37.0%和總產(chǎn)量的47.9%[1]，甜瓜產(chǎn)業(yè)具有較強國際競爭力和經(jīng)濟增長空間。2009年啟動的國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，將甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展推向更廣闊的平臺。種質(zhì)資源是育種和有關(guān)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，因此發(fā)展甜瓜產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵在于有效、合理地利用種質(zhì)資源，對其進行全面的研究和鑒定，并做出科學(xué)評價。甜瓜育種實踐表明，用于雜交的兩個親本品種(材料)，其綜合性狀水平應(yīng)最大限度的保持互補性，但血緣關(guān)系要盡可能的遠，這樣才能選育出具有突破性的新品種。目前在新品種選育過程中，有集中利用少數(shù)親本的傾向，導(dǎo)致育成品種親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)狹窄。因此，明確育種材料的遺傳多樣性和血緣組成已成為甜瓜育種的重要基礎(chǔ)工作。

　　利用分子標(biāo)記研究甜瓜遺傳多樣性已有報道，所用標(biāo)記涉及RAPD[2]、SSR[3，4]、AFLP[5，6]、SRAP[7]等，隨著測序技術(shù)的不斷提高和分子生物學(xué)研究的深入，大量瓜類作物的EST 被測序，迄今為止，國際葫蘆科基因組計劃研究小組共收錄有關(guān)甜瓜的EST 129 067條[8]。基于EST庫開發(fā)的SSR標(biāo)記稱為EST-SSR。相對于基因組SSR，EST-SSR充分利用現(xiàn)有的測序數(shù)據(jù)，省去了SSR引物開發(fā)過程中的文庫構(gòu)建和測序等步驟，降低了成本。另外，EST-SSR來源于基因編碼區(qū)，可能與功能基因的表達具有直接的聯(lián)系，其保守程度更高，在不同物種間有一定的通用性，其多態(tài)性也反映了功能的多樣性。因此，EST-SSR標(biāo)記特別適用于種質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究和種質(zhì)資源的遺傳多樣性評價[9-11]。

　　多態(tài)性信息含量PIC是度量標(biāo)記多態(tài)性檢測能力的工具，PIC綜合考慮了等位基因的數(shù)量和頻率，能有效地度量DNA標(biāo)記檢測的信息度，已被廣泛地應(yīng)用于分子標(biāo)記多態(tài)性檢測能力的評價[9，12]。

　　本研究采用EST-SSR標(biāo)記來分析甜瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，明確甜瓜種質(zhì)的遺傳關(guān)系，為其分類提供依據(jù)，以期指導(dǎo)育種中合理選擇選配親本，從而減少育種的盲目性，加快遺傳改良進程。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　選用59份甜瓜材料用于多態(tài)性的分析，其中28份為武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所西甜瓜資源與育種研究室收集后經(jīng)過3～5代自交提純留種，4份由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所王懷松研究員提供，4份由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心伊鴻平研究員提供，8份由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)別之龍教授提供，5份由新疆鄧建新老師提供，10份來源于2012年全國西甜瓜區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗光皮組甜瓜品種。試驗材料的名稱及編號見表1。

　　1.2 方法

　　1.2.1 甜瓜基因組DNA提取和濃度測定 將供試材料播種于溫室中，待甜瓜長出3～4片真葉時，隨機選取3株，每株取一片較大的真葉，置于研缽中研磨，采用改良的CTAB法[13]提取甜瓜基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳及紫外分光光度法檢測DNA的濃度與純度，稀釋為30 ng/μL，-20 ℃保存。

　　1.2.2 EST-SSR引物信息 從前人研究結(jié)果[9，14]中初步選取46對引物來進行EST-SSR引物的篩選，其中有23對引物具有多態(tài)性，引物信息如表2所示。

　　1.2.3 SSR分析 PCR反應(yīng)的總體系為10 μL，含有1×Buffer 1 μL，2 mmol/L MgCl2 1 μL，200 μmol/L dNTPs 1 μL，0.2 μmol/L 上、下游引物各1 μL，0.5 U Taq酶 0.2 μL，20 ng DNA 0.5 μL，ddH2O補至10 μL。Taq酶和引物均購自上海生工生物有限公司。PCR擴增程序參考孔秋生[15]的方法，擴增產(chǎn)物采用8%非變性PAGE凝膠進行檢測。

　　1.2.4 數(shù)據(jù)分析

　　1)多態(tài)性信息含量：根據(jù)以下公式計算PIC值。

　　式中，k是一個SSR所檢測到的等位基因的數(shù)量，Pi是第i個等位基因的頻率。

　　2)聚類分析：將電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒有出現(xiàn)的條帶記為“0”，生成由“1”和“0”組成的原始矩陣，采用NTSYS-pc 2.10e軟件進行數(shù)據(jù)分析。對原始矩陣用SimQual程序求SM相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣。采用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

　　3)主坐標(biāo)分析：采用NTSYS-pc 2.10e軟件對EST-SSR標(biāo)記獲得的原始0、1矩陣進行主坐標(biāo)分析。對原始矩陣求得的相似系數(shù)矩陣，采用DCENTER程序?qū)ο禂?shù)矩陣進行轉(zhuǎn)換，再用EIGEN程序求出特征值和特征向量，并做主坐標(biāo)之間的二維圖和三維圖。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 EST-SSR標(biāo)記的PIC值

　　46對EST-SSR標(biāo)記中有23對擴增出清晰條帶，其中引物CM38的擴增圖譜如圖1所示。在這23對引物中，引物CM33檢測到的PIC值最小，為0.239;引物CM38檢測到的PIC值最大為0.588，在59個甜瓜基因型中，23個EST-SSR標(biāo)記檢測到的PIC值的分布范圍為0.239～0.588，平均PIC值為0.387(表3)。

　　2.2 甜瓜種質(zhì)的聚類分析

　　對59份甜瓜種質(zhì)進行檢測，共檢測到54個多態(tài)性位點。對結(jié)果進行統(tǒng)計，生成0、1矩陣，計算種質(zhì)之間的簡單匹配系數(shù)(SM)，利用UPGMA法進行聚類分析。59份甜瓜種質(zhì)兩兩之間的SM系數(shù)范圍為0～0.981。其中風(fēng)味5號和A23之間、雪里紅和A23之間的相似系數(shù)均為0，表明風(fēng)味5號和雪里紅這2份種質(zhì)與A23之間的遺傳差異最大。風(fēng)味5號和雪里紅是厚皮甜瓜，而A23是薄皮甜瓜，兩者之間的相似系數(shù)最低也反映了厚皮甜瓜和薄皮甜瓜種質(zhì)之間存在的遺傳差異。IVF55和來鳳之間、翠玉和來鳳之間的相似系數(shù)均為0.981，表明IVF55和翠玉這2份種質(zhì)與來鳳之間的遺傳差異最小，這3份種質(zhì)均為薄皮甜瓜。

　　采用UPGMA算法進行聚類分析，得到這59份甜瓜種質(zhì)資源聚類圖(圖2)。從圖2可以看出，在相似系數(shù)為0.19處，59份甜瓜種質(zhì)可以分為兩類：第一類是包括Ba-2在內(nèi)的薄皮甜瓜種質(zhì)和大部分厚皮甜瓜種質(zhì);第二類僅包括薄皮甜瓜A23和厚皮甜瓜A41共2份種質(zhì)。

　　在相似系數(shù)為0.58處，這兩類甜瓜種質(zhì)又可以進一步細分。第一類可以細分為3個組：第一組包括Ba-2、A3等9份種質(zhì);第二組僅包括1份種質(zhì)GQ-219;第三組包括網(wǎng)絡(luò)時代2號和A44在內(nèi)的47份種質(zhì)。其中第一組均為薄皮甜瓜，而第三組種質(zhì)基本上沒有共同的表型特征。由于所用的甜瓜種質(zhì)材料大部分是提供的商品種，品種選育過程中種質(zhì)之間的遺傳交流等因素可能是造成品種分類混雜的主要原因。

　　2.3 甜瓜種質(zhì)的主坐標(biāo)分析

　　對46個EST-SSR標(biāo)記在59份甜瓜種質(zhì)上擴增的結(jié)果進行主坐標(biāo)分析，前三個主坐標(biāo)能解釋全部變異的40.85%，其中第一主坐標(biāo)所解釋的變異占25.81%，第二主坐標(biāo)和第三主坐標(biāo)所能解釋的變異分別占7.82%和7.22%。對前兩個主坐標(biāo)和前3個主坐標(biāo)分別做59份種質(zhì)的二維圖和三維圖，結(jié)果見圖3和圖4。

　　從二維圖上(圖3)可以看出，EST-SSR能清楚地區(qū)分厚皮甜瓜和薄皮甜瓜。在圖中左部分分布的是厚皮甜瓜，本試驗選取的大部分甜瓜種質(zhì)材料為厚皮甜瓜。右部分分布的是薄皮甜瓜種質(zhì)，包括Ba-2、Bc-2、IVF55、B9、翠玉、香甜王子、來鳳地方甜瓜7份，這些種質(zhì)在二維圖上聚集在一起。

　　為進一步細分種質(zhì)，繼續(xù)做分辨率更高的前3個主坐標(biāo)的三維圖。從三維圖上(圖4)可以看出，厚皮甜瓜和薄皮甜瓜之間，以及厚皮甜瓜之間的差異更加明顯，但7份薄皮甜瓜種質(zhì)在圖上仍然呈連續(xù)分布。

　　從46個EST-SSR標(biāo)記對59份甜瓜種質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析結(jié)果可以看出，EST-SSR能夠有效區(qū)分厚皮甜瓜和薄皮甜瓜之間的遺傳差異，且檢測出的厚皮甜瓜遺傳變異呈連續(xù)分布，沒有表現(xiàn)出明顯的特征。

　　從獲取的EST-SSR數(shù)據(jù)來源中可見，本研究選用的部分標(biāo)記可能存在如表4所列的功能。通過同源性搜索獲得的這些功能，實際上也反映了本試驗選用的甜瓜種質(zhì)中存在這些基因的功能多樣性。

　　3 結(jié)論與討論

　　在鑒定甜瓜品種資源親緣關(guān)系上，SSR能夠彌補單獨依靠表型鑒別親緣關(guān)系的不足，本研究利用SSR分子標(biāo)記將59份材料分類聚成薄皮和厚皮兩大類型，厚皮類型還可細分為果皮帶網(wǎng)紋或光皮、果皮黃色或白色等類別，但聚類分析結(jié)果沒能將果肉顏色、肉質(zhì)是否松脆、果型等形態(tài)學(xué)上的差異區(qū)分開，同一類型中各品種間的遺傳相似系數(shù)比較大，說明遺傳背景狹窄，差異不大，這與試驗材料的覆蓋面不夠廣有一定關(guān)系。

　　PIC值的分布范圍為0～1，PIC值越大表明標(biāo)記檢測多態(tài)性的能力越強。在本研究中，甜瓜EST-SSR標(biāo)記的PIC值分布范圍為0.239～0.588。由于試驗使用的甜瓜材料大多是厚皮甜瓜品種，只是甜瓜遺傳變異中的很小一部分，如擴大試驗材料的來源，甜瓜EST-SSR所檢測的PIC值可能要高一些。另外，本研究中甜瓜EST-SSR的平均PIC值要低于其他研究中報道的來自基因組標(biāo)記的PIC值[9]，這是由于EST-SSR來自于序列保守的轉(zhuǎn)錄區(qū)，其變異的豐富度不及基因組非轉(zhuǎn)錄區(qū)的緣故。

　　利用SSR標(biāo)記進行遺傳多樣性分析需要有足夠的SSR引物，理想的狀況是根據(jù)基因組來設(shè)計覆蓋范圍廣的引物。如何開發(fā)更加經(jīng)濟有效的共顯性固定標(biāo)記是分子研究迫切的要求。目前，葫蘆科中甜瓜、西瓜和黃瓜的基因組測序均已完成，這將極大的推動葫蘆科瓜類作物基因組學(xué)的研究，促進發(fā)掘新的EST-SSR，避免簡單的重復(fù)性工作，論文范文深化EST-SSR的研究。

　　致謝：本試驗得到新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心伊鴻平研究員和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院孔秋生副教授在資源搜集方面的支持及試驗方面的悉心指導(dǎo)，在此一并表示衷心感謝。

　　參考文獻：

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　　閱讀期刊：中國瓜菜

　　《中國瓜菜》China Cucurbits and Vegetables(雙月刊)曾用刊名：中國西瓜甜瓜，1988年創(chuàng)刊，報道西瓜甜瓜科研、生產(chǎn)、市場新動態(tài)，交流科研成果和生產(chǎn)經(jīng)驗，介紹先進技術(shù)，推廣優(yōu)良品種，傳遞西、甜瓜行業(yè)信息。